Sie bekommen eine vorhergesagte Struktur mit einer einzigen angehängten Zahl zurück: pLDDT 83. Jemand will wissen, ob sich die Bindestelle andocken lässt. Der globale Mittelwert kann das nicht beantworten, und in einem unserer eigenen Läufe erreichte genau der Rest, auf den es ankam, nur etwas über 30, während der Mittelwert über die Kette brauchbar aussah. pLDDT ist nützlich, aber nur, wenn man den Wert je Rest liest und weiß, wodurch er bestimmt wird.
Was pLDDT tatsächlich misst
pLDDT ist der predicted local distance difference test-Score des Modells: eine Pro-Rest-Schätzung von 0 bis 100, wie gut die lokale Umgebung dieses Restes mit einer experimentellen Struktur übereinstimmen würde. Daraus folgen unmittelbar zwei Dinge.
Er ist lokal, nicht global. Ein pLDDT von 95 bei Rest 12 sagt, dass die Nachbarschaft von Rest 12 wahrscheinlich richtig ist. Er sagt nichts darüber, ob die Domäne, in der er sitzt, relativ zu einer anderen Domäne korrekt platziert ist. Für die Platzierung zwischen Domänen oder Ketten braucht man stattdessen PAE (predicted aligned error), pTM oder ipTM.
Er ist eine Selbsteinschätzung, keine Validierung. Das Modell sagt voraus, wie gut seine eigene Antwort ist. Diese Schätzung ist für Ziele, die der Trainingsverteilung ähneln, gut kalibriert und wird außerhalb davon schlechter; genau das zeigen die Zahlen unten.
Der oft zitierte Gesamtwert für eine Kette ist nur der Mittelwert über die Reste. Er fasst eine Verteilung zusammen und kann wie jeder Mittelwert täuschen.
Die Bänder
Das sind die konventionellen, von AlphaFold abgeleiteten Bänder.
| pLDDT | Band | Was man damit tun kann |
|---|---|---|
| über 90 | Sehr hoch | Rückgrat und die meisten Seitenkettenrotamere verlässlich. Nutzbar für Docking, Modellierung von Mutationen und Taschenanalyse. |
| 70 bis 90 | Zuverlässig | Rückgrat allgemein verlässlich, Seitenketten weniger. Gut für Faltung und Topologie; Rotamerdetails mit Vorsicht behandeln. |
| 50 bis 70 | Niedrig | Als Hypothese behandeln. Das Rückgrat kann grob richtig sein, muss es aber nicht. Hier nicht docken und die Pose als aussagekräftig ausgeben. |
| unter 50 | Sehr niedrig | Keine brauchbare Strukturvorhersage. Oft ein starker Hinweis auf intrinsische Unordnung und nicht schon deshalb ein Fehler. |
Die letzte Zeile wird am häufigsten missverstanden und bekommt daher einen eigenen Abschnitt.
Niedriger pLDDT ist nicht immer ein Fehler
Für intrinsisch ungeordnete Regionen ist ein Score unter 50 das Modell, das richtig liegt. Es gibt keine einzelne native Konformation, die vorherzusagen wäre, und die publizierten AlphaFold-Arbeiten haben gezeigt, dass ein niedriger pLDDT so gut mit Unordnung korreliert, dass er selbst zur Vorhersage von Unordnung dient. Eine flexible Schleife, ein terminaler Abschnitt oder ein Linker zwischen zwei gefalteten Domänen liegen regelmäßig unter 50, während die gefalteten Kerne über 90 liegen.
Bevor man ein Modell als schlecht bezeichnet, sollte man fragen: Welche Reste haben niedrige Werte, und gibt es für diese Reste überhaupt einen Grund, geordnet zu sein? Dafür braucht man neben dem globalen Mittelwert die Liste der Reste niedriger Konfidenz und die größte zusammenhängende Region davon. Ein Modell mit einem 40 Reste langen ungeordneten Abschnitt bei pLDDT 35 und einem Kern bei 95 ist ein gutes Modell, dessen globaler Mittelwert in die Irre führt.
Der eigentliche Fehlerfall sieht anders aus: niedrige Konfidenz verteilt *innerhalb* einer Region, die eine gefaltete, konservierte Domäne sein sollte. Dann sagt das Modell, dass es die Faltung nicht kennt.
Durchgerechnetes Beispiel: dasselbe Konstrukt, vier Zahlen
Das sind eigene gemessene Daten von CovaSyn zu KRAS G12C (189 Aminosäuren) und das klarste Beispiel, das wir haben, was den pLDDT tatsächlich bestimmt.
| Konfiguration | Mittlerer pLDDT | Anteil hoher Konfidenz (ab 70) | pLDDT bei Rest 12 (die G12C-Stelle) |
|---|---|---|---|
| Strukturvorhersage ohne MSA (Einzelsequenz) | 49,4 (eine Wiederholung in einer späteren Sitzung: 51,22) | 1 bis 12 % | 32 bis 37 |
| Methode, die bauartbedingt nur die Einzelsequenz nutzt | 83,1 | 89 % | nicht erhoben |
| Strukturvorhersage mit MSA, Tiefe 3913 | 94,74 | 98,9 % | 95,47 |
| Strukturvorhersage mit MSA, Tiefe 8112 bzw. 16.917 | 94,59 bzw. 94,74 | 98,4 % | 95,61 |
Gleiche Sequenz, gleiche Modellgewichte in den Zeilen 1, 3 und 4. Die einzige Variable ist, ob das Modell ein multiples Sequenzalignment erhielt.
Für die Interpretation heißt das: In der Zeile ohne MSA ist der Mittelwert von 49,4 ehrlich, fast nichts an diesem Modell ist belastbar, und die Mutationsstelle selbst liegt bei 32 bis 37. Dabei ist dies *kein* Ziel, das von sich aus niedrige Konfidenz liefert: Mit koevolutionärem Signal erreicht derselbe Rest 95,5. Hätte man nur den globalen Mittelwert um 50 gesehen, hätte man KRAS womöglich als schwieriges Ziel abgetan. Das ist es nicht, der Vorhersage fehlte nur die Eingabe.
Die zweite Lehre: Die MSA-Tiefe erreicht eine Sättigung. Der Schritt von 3913 auf 16.917 Sequenzen veränderte den Mittelwert um 0,15 pLDDT-Punkte, deutlich innerhalb der Streuung zwischen einzelnen Läufen. Die Tiefe zählt bis zu einem bestimmten Punkt sehr viel und danach nichts mehr.
Zum Vergleich: Mit derselben Konfiguration ohne MSA erreichte eine Ubiquitin-Kontrolle 93,3 bei 97 % Resten hoher Konfidenz. Klein, kompakt, in den Daten stark vertreten: An der Methode lag es nie, das Bild hing vom Ziel ab. Deshalb sollte man bei einer Aussage wie „unsere Faltung ist gut, wir haben 93 gemessen“ immer nach der zugrunde liegenden Zielliste fragen.
Unsere aktuell dokumentierten Monomerläufe mit MSA:
| Ziel | Länge | Mittlerer pLDDT | MSA-Tiefe |
|---|---|---|---|
| Ubiquitin | 76 Aminosäuren | 97,19 | 9640 |
| KRAS G12C | 189 Aminosäuren | 94,61 | 7513 |
| CDK2 | 298 Aminosäuren | 94,79 | 9523 |
Das sind Monomerfaltungen an drei Zielen, die alle gut untersuchte Proteine sind. Sie sind kein Benchmark und nicht als erwartete Genauigkeit für eine neuartige Sequenz ohne Homologe zu lesen.
Ein praktisches Entscheidungsverfahren
1. Das Profil je Rest vor dem Mittelwert ansehen. Liegt nur ein Mittelwert vor, fordern Sie die Werte je Rest an. 2. Die Region bewerten, die Sie tatsächlich nutzen. Wer in eine Tasche dockt, liest den pLDDT der Reste dieser Tasche. Wer eine Punktmutation modelliert, liest den Wert dieses Restes. Ein globaler Wert von 83 mit einer 35 an der interessierenden Stelle ist ein klares Nein. 3. Prüfen, ob die Bereiche mit niedrigen Werten überhaupt geordnet sein sollten. Termini und Linker unter 50 sind zu erwarten, ein Beta-Faltblatt mit niedriger Konfidenz in einer konservierten Domäne nicht. 4. Die für den Lauf gemeldete MSA-Tiefe prüfen. Fehlt sie oder ist sie sehr gering, liegt eine Vorhersage aus einer Einzelsequenz vor, und die Konfidenzschätzung liegt außerhalb ihres kalibrierten Bereichs. 5. Bei Komplexen den pLDDT nicht mehr heranziehen. Nutzen Sie ipTM für die Konfidenz der Kontaktfläche und PAE für die relative Platzierung. Zum Vergleich: Unsere Komplexvorhersage zu KRAS G12C ergab ein ipTM von 0,99, der Ubiquitin-Komplex 0,63; dasselbe Verfahren, völlig unterschiedliche Konfidenz an der Kontaktfläche. Der pLDDT des Monomers hätte das nicht gezeigt.
Was pLDDT nicht sagt
- Ob die Konformation die biologisch relevante ist. Apo- oder Holoform, aktive oder inaktive Kinasekonformation, welcher von mehreren zugänglichen Zuständen: All das ist für den pLDDT unsichtbar. Ein Modell mit 95 kann zuverlässig den falschen Zustand zeigen.
- Ob Domänen korrekt angeordnet sind. Das ist die Aufgabe von PAE.
- Irgendetwas über die Kontaktfläche in einem Komplex. Das ist die Aufgabe von ipTM.
- Ob ein Ligand bindet. Die Konfidenz einer Struktur ist keine Affinität. Nachgelagerte Docking-Scores tragen ihre eigene Unsicherheit.
- Ob die Vorhersage richtig ist. Es ist eine kalibrierte Schätzung, und die Kalibrierung gilt nur für die Trainingsverteilung. Entworfene, synthetische oder verwaiste Sequenzen ohne Homologe liegen außerhalb davon.
- Irgendetwas, das man in ein Dossier schreiben kann. Vorhergesagte Strukturen dienen der Triage und dem Entwurf. Der Beleg bleibt die experimentelle Strukturbestimmung.
Häufige Fragen
Was ist ein guter pLDDT-Score?
Über 90 bedeutet sehr hohe Konfidenz: Rückgrat und die meisten Seitenketten sind zuverlässig genug für Docking und die Modellierung von Mutationen. 70 bis 90 ist zuverlässig, mit im Allgemeinen korrektem Rückgrat und weniger sicheren Seitenkettendetails. 50 bis 70 ist nur als Hypothese zu behandeln. Unter 50 liegt keine brauchbare Strukturvorhersage vor, oft aber ein korrektes Signal für intrinsische Unordnung statt eines fehlgeschlagenen Laufs.
Reicht ein pLDDT von 70 für Docking?
Für sich allein in der Regel nicht. Entscheidend ist der pLDDT der Reste in der Tasche, nicht der Mittelwert über die Kette. Ein Modell mit dem Mittelwert 70 kann eine Bindestelle bei 85 haben (brauchbar) oder bei 40 (nicht brauchbar). Lesen Sie die Werte je Rest für die Reste aus, welche die Bindestelle auskleiden, und beurteilen Sie diese. Docking in eine Tasche mit niedriger Konfidenz erzeugt Posen, die plausibel aussehen und nichts bedeuten.
Warum ist mein pLDDT niedrig, obwohl das Protein gut untersucht ist?
Die häufigste Ursache ist ein fehlendes oder flaches multiples Sequenzalignment. In eigenen KRAS-G12C-Läufen erreichte dasselbe Konstrukt einen mittleren pLDDT von 49,4 ohne MSA und 94,74 mit einer MSA der Tiefe 3913; die Mutationsstelle selbst stieg von etwa 32 auf 95,5. Prüfen Sie die für Ihren Lauf gemeldete MSA-Tiefe, bevor Sie das Ziel für schwierig halten.
Was ist der Unterschied zwischen pLDDT, pTM und ipTM?
pLDDT wird je Rest angegeben und ist lokal: Er schätzt, wie korrekt die unmittelbare Umgebung jedes Restes ist. pTM schätzt die globale Genauigkeit der Faltung einer ganzen Kette. ipTM schätzt die Genauigkeit der Kontaktfläche zwischen Ketten in einem Komplex. Für ein Monomer liest man den pLDDT, für die Anordnung der Domänen den PAE und für eine Kontaktfläche zwischen Proteinen oder zwischen Protein und Ligand das ipTM. Sie sind nicht austauschbar.
Bedeutet niedriger pLDDT, dass die Region ungeordnet ist?
Oft ja. Ein niedriger pLDDT korreliert stark mit intrinsischer Unordnung, und die AlphaFold-Autoren haben das so gut dokumentiert, dass der Score zur Vorhersage von Unordnung genutzt wird. Terminale Abschnitte und Linker zwischen Domänen liegen auch in ansonsten sehr guten Modellen regelmäßig unter 50. Bedenklich ist das Muster einer niedrigen Konfidenz, die sich über eine Region erstreckt, welche eine kompakte, konservierte, gefaltete Domäne sein sollte.
Liefert eine tiefere MSA immer eine bessere Struktur?
Nein. Die Tiefe zählt bis zu einem bestimmten Punkt sehr viel und erreicht dann eine Sättigung. In den KRAS-G12C-Läufen von CovaSyn ergab eine MSA-Tiefe von 3913 einen mittleren pLDDT von 94,74, eine Tiefe von 16.917 ebenfalls 94,74; der Unterschied liegt innerhalb der Streuung zwischen einzelnen Läufen. Von null Homologen auf einige Tausend zu kommen, verändert alles. Von einigen Tausend auf sechzehntausend in der Regel nicht.
Weiterführende Beiträge
Gerechnet mit CovaSyn
Die Zahlen in diesem Artikel stammen aus unseren Werkzeugen.
- Protein-Folding und Strukturvorhersage.