In der MS/MS bricht ein Peptid vor allem an den Amidbindungen des Rückgrats. Jeder Bruch ergibt zwei Stücke: Das b-Ion behält den N-Terminus, das y-Ion den C-Terminus. Der Massenunterschied zwischen benachbarten b-Ionen oder benachbarten y-Ionen ist genau ein Aminosäurerest, deshalb liest eine Leiter aus b- oder y-Ionen die Sequenz direkt ab. Die Identität ist bestätigt, wenn die Vorläufermasse passt und eine lückenlose oder nahezu lückenlose Fragmentserie innerhalb der Massengenauigkeit des Geräts zur erwarteten Sequenz passt.
Dieser Artikel geht die Regeln durch, rechnet ein vollständiges Beispiel und zeigt, wo ein passendes Spektrum die Identität trotzdem offen lässt.
Wie berechnet man b- und y-Ionen?
Für einfach geladene Ionen mit monoisotopischen Restmassen:
- b-Ion = Summe der Restmassen vom N-Terminus bis zum Bruch + 1,00728 (ein Proton)
- y-Ion = Summe der Restmassen vom Bruch bis zum C-Terminus + 18,01056 (Wasser) + 1,00728
Das b-Ion trägt kein Wasser, weil die C-terminale OH-Gruppe beim y-Fragment bleibt. Zwei Folgen sind für die Prüfung nützlich: b(i) + y(n − i) ergibt den einfach protonierten Vorläufer plus ein Proton, und das y1-Ion eines tryptischen Peptids liegt immer bei 147,113 (Lysin) oder 175,119 (Arginin).
Ein durchgerechnetes Beispiel: LVNELTEFAK
LVNELTEFAK ist ein bekanntes tryptisches Peptid aus Rinderserumalbumin. Seine neutrale monoisotopische Masse beträgt 1162,6234 Da, der zweifach geladene Vorläufer erscheint also bei m/z 582,3190, der einfach geladene bei 1163,6306.
| i | b-Ion | m/z | y-Ion | m/z |
|---|---|---|---|---|
| 1 | L | 114,0913 | K | 147,1128 |
| 2 | LV | 213,1597 | AK | 218,1499 |
| 3 | LVN | 327,2027 | FAK | 365,2183 |
| 4 | LVNE | 456,2453 | EFAK | 494,2609 |
| 5 | LVNEL | 569,3293 | TEFAK | 595,3086 |
| 6 | LVNELT | 670,3770 | LTEFAK | 708,3927 |
| 7 | LVNELTE | 799,4196 | ELTEFAK | 837,4352 |
| 8 | LVNELTEF | 946,4880 | NELTEFAK | 951,4782 |
| 9 | LVNELTEFA | 1017,5251 | VNELTEFAK | 1050,5466 |
Lies die y-Serie von unten nach oben, und die Differenzen ergeben die Sequenz vom C-Terminus her: 218,150 − 147,113 = 71,037 (A), 365,218 − 218,150 = 147,068 (F), 494,261 − 365,218 = 129,043 (E) und so weiter. Die b-Serie liest dieselbe Sequenz vom anderen Ende. Prüfe ein komplementäres Paar: b4 + y6 = 456,2453 + 708,3927 = 1164,6380, also [M+H]+ von 1163,6306 plus ein Proton.
In einem echten Spektrum siehst du selten alle achtzehn Ionen. b1 fehlt meist, y-Ionen dominieren bei tryptischen Peptiden auf vielen Geräten, weil der basische C-terminale Rest die Ladung hält, und bei längeren Peptiden erscheinen zweifach geladene Fragmente. Entscheidend ist die Abdeckung: wie viele Bindungen durch mindestens ein Fragment belegt sind.
Was zählt als bestätigte Identität?
Eine belastbare Identitätsaussage verbindet vier Dinge:
1. Vorläufermasse innerhalb der Gerätetoleranz, zum Beispiel 5 ppm auf einem Orbitrap oder Q-TOF. 2. Fragmentabdeckung über die Sequenz, mit aufeinanderfolgenden Ionen in mindestens einer Serie und beiden Serien, wo die Sequenz mehrdeutig ist. 3. Massengenauigkeit der Fragmente, jedes zugeordnete Fragment innerhalb einer angegebenen Toleranz, zum Beispiel 10 ppm oder 0,02 Da. 4. Keine bessere Erklärung: Die erwartete Sequenz erklärt die Hauptpeaks besser als plausible Alternativen wie eine Sequenzvariante, eine Verkürzung oder eine Modifikation.
Für ein synthetisches Peptid oder einen Peptidwirkstoff ist das der Beleg hinter dem Identitätstest. Für ein Biologikum wird dieselbe Logik, angewandt auf alle Peptide eines Verdaus, zur Peptidkarte.
Wo lässt ein passendes Spektrum die Frage trotzdem offen?
- Leucin und Isoleucin haben dieselbe Masse (113,084 Da). Standard-CID oder HCD unterscheiden sie nicht. Wenn es darauf ankommt, braucht es w-Ionen aus ETD/EThcD, eine Aminosäureanalyse oder das Wissen aus der Synthese.
- Glutamin und Lysin unterscheiden sich um 0,036 Da. Bei hoher Auflösung trennen sie sich, bei niedriger nicht.
- Deamidierung (N zu D, +0,984 Da) verschiebt jedes Fragment, das den Rest enthält. Verschieben sich die y-Ionen nach dem Asparagin und die davor nicht, ist die Stelle lokalisiert; fehlt die Abdeckung um die Stelle, ist sie es nicht.
- Oxidation von Methionin (+15,995 Da) verhält sich genauso und ist ein häufiges Artefakt der Probenhandhabung.
- Isobare Vertauschungen: Zwei benachbarte Reste in umgekehrter Reihenfolge ergeben denselben Vorläufer und ändern nur die Fragmente dazwischen. Ohne Fragment an dieser Bindung ist die Reihenfolge nicht belegt.
Praktische Prüfungen vor dem Bericht
- Bestätige den Ladungszustand des Vorläufers aus dem Isotopenabstand, nicht nur aus der Zuordnung der Software.
- Annotiere beide Serien und markiere, welche Bindungen abgedeckt sind; gib die Abdeckung als Zahl der Bindungen von n − 1 an.
- Zeige bei modifizierten Peptiden mindestens ein Fragment auf jeder Seite des modifizierten Rests.
- Halte Rohdatei, theoretische Fragmentliste und Toleranz zusammen, damit die Zuordnung reproduzierbar ist.
Häufige Fragen
Was ist der Unterschied zwischen b- und y-Ionen?
Beide entstehen aus der Spaltung einer Peptidbindung. Das b-Ion enthält den N-terminalen Teil und trägt kein zusätzliches Wasser; das y-Ion enthält den C-terminalen Teil und trägt das C-terminale Wasser. Für einfach geladene Ionen gilt b = Restsumme + 1,00728 und y = Restsumme + 18,01056 + 1,00728.
Warum sind y-Ionen bei tryptischen Peptiden oft stärker als b-Ionen?
Trypsin hinterlässt Lysin oder Arginin am C-Terminus. Deren basische Seitenketten halten das Proton, deshalb bleiben C-terminale Fragmente eher geladen und werden detektiert.
Wie viele Fragmente brauche ich, um eine Peptidsequenz zu bestätigen?
Eine feste Zahl gibt es nicht, aber die Abdeckung der meisten Rückgratbindungen mit aufeinanderfolgenden Ionen in mindestens einer Serie plus eine genaue Vorläufermasse sind die übliche Grundlage. Mehrdeutige Stellen wie eine Modifikation oder zwei mögliche Reihenfolgen brauchen Fragmente, die genau diese Frage auflösen.
Kann MS/MS Leucin von Isoleucin unterscheiden?
Mit Standard-CID oder HCD nicht, weil beide dieselbe Masse haben und dieselben b- und y-Ionen liefern. ETD oder EThcD können seitenkettenspezifische w-Ionen erzeugen; sonst kommt die Unterscheidung aus der Aminosäureanalyse oder der bekannten Synthese.
Was ergibt b + y?
Für komplementäre, einfach geladene Ionen aus derselben Spaltung ergibt b(i) + y(n − i) die Masse des einfach protonierten Vorläufers plus ein Proton. Im Beispiel ist b4 + y6 = 1164,6380, also [M+H]+ von 1163,6306 plus 1,0073.